biopsies เหลวใช้เนื้อเยื่อเนื้องอกในเลือด - เพื่อวินิจฉัยมะเร็ง
โดยปกติแล้วเนื้องอกจะถูกตรวจสอบโดยใช้เนื้อเยื่อเนื้อเยื่อ ตัวอย่างเล็ก ๆ จะถูกนำมาจากเนื้องอกและ genotyped หรือวิเคราะห์เกี่ยวกับการแต่งหน้าทางพันธุกรรม ปัญหาที่เกิดขึ้นกับวิธีนี้คือการตัดเนื้อเยื่อเนื้องอกอาจเป็นเรื่องที่ท้าทาย นอกจากนี้การตรวจชิ้นเนื้อของเนื้องอกยังให้ภาพรวมของเนื้องอกเท่านั้น
การเขียนใน เวชศาสตร์การค้นพบ ในปีพ. ศ. 2015 Labgaa และผู้ร่วมเขียนกล่าวถึงเรื่องการตรวจชิ้นเนื้อแบบเดิม:
ด้วยเหตุผลที่ชัดเจนการติดตามวิวัฒนาการเนื้องอกโดยการตรวจชิ้นเนื้อตามลำดับเป็นเรื่องยาก นอกจากนี้การตรวจชิ้นเนื้อเพียงจุดเดียวของเนื้องอกและดังนั้นจึงไม่น่าจะเป็นตัวแทนของสเปกตรัมทั้งหมดของการกลายพันธุ์ของโซมาติกในเนื้องอกขนาดใหญ่ ทางเลือกหนึ่งคือการได้รับ biopsies หลายตัวสำหรับเนื้องอกเดียวกัน แต่ตัวเลือกนี้ดูเหมือนว่าจะไม่เป็นจริงและถูกต้อง
การตรวจชิ้นเนื้อเยื่อเหลวเกี่ยวข้องกับการวัดดีเอ็นเอในกระแสเลือด (ctDNA) และผลพลอยได้จากเนื้องอกอื่น ๆ ในตัวอย่างเลือดที่ได้รับจากผู้ป่วยมะเร็ง วิธีการวินิจฉัยที่เกิดขึ้นใหม่นี้จะเป็นไปอย่างรวดเร็วไม่เป็นอันตรายและคุ้มค่า
ประวัติของการตรวจชิ้นเนื้อของเหลว
ในปี ค.ศ. 1948 Mandel และMétaisนักวิจัยชาวฝรั่งเศสคนแรกระบุว่า ctDNA ในเลือดของคนที่มีสุขภาพดี การค้นพบครั้งนี้เกิดขึ้นก่อนเวลาของมันและไม่นานหลายทศวรรษหลังจากที่ ctDNA ถูกสำรวจต่อไป
ในปีพศ. 2520 ลีออนและเพื่อนร่วมงานได้ระบุถึงจำนวน ctDNA ที่เพิ่มขึ้นในเลือดของผู้ป่วยโรคมะเร็ง
โดย 1989, Stroun และเพื่อนร่วมงานระบุลักษณะของมะเร็ง (เช่นมะเร็ง) ในเลือด หลังจากการค้นพบเหล่านี้กลุ่มอื่น ๆ หลายกลุ่มระบุการกลายพันธุ์ที่เฉพาะเจาะจงในตัวยับยั้งเนื้องอกและ oncogenes ความไม่เสถียรของ microsatellite และ DNA methylation ซึ่งพิสูจน์ให้เห็นว่า ctDNA ถูกปล่อยออกสู่เนื้องอกด้วยเนื้องอก
แม้ว่าเรารู้ว่า ctDNA ที่ได้จากเซลล์เนื้องอกจะไหลเวียนอยู่ในเลือด แต่กำเนิดอัตราการปลดปล่อยและกลไกการปลดปล่อยดีเอ็นเอนี้ยังไม่เป็นที่แน่ชัดด้วยผลการวิจัยที่ให้ผลลัพธ์ที่ขัดแย้งกัน งานวิจัยบางชิ้นแสดงให้เห็นว่าเนื้องอกที่ร้ายแรงกว่ามีเซลล์มะเร็งที่ตายแล้วและปล่อย ctDNA เพิ่มขึ้น อย่างไรก็ตามการวิจัยบางอย่างแสดงให้เห็นว่าเซลล์ทั้งหมดปลดปล่อย ctDNA อย่างไรก็ตามดูเหมือนว่ามีแนวโน้มว่าเนื้องอกที่เป็นมะเร็งจะปลดปล่อย ctDNA เข้าไปในเลือดทำให้ ctDNA เป็นตัวบ่งชี้มะเร็งที่ดี
เนื่องจากการกระจายตัวที่หนักและความเข้มข้นต่ำในเลือด ctDNA จึงยากที่จะแยกและวิเคราะห์ มีความแตกต่างของความเข้มข้นของ ctDNA ระหว่างตัวอย่างซีรัมและพลาสมา ดูเหมือนว่าซีรั่มในเลือดมากกว่าเลือดพลาสมาเป็นแหล่งที่ดีขึ้นของ ctDNA ในการศึกษาโดย Umetani และเพื่อนร่วมงานพบว่าความเข้มข้นของ ctDNA ลดลงอย่างต่อเนื่องในพลาสมาเมื่อเทียบกับซีรัมเนื่องจากการสูญเสียการไหลเวียนของดีเอ็นเอในระหว่างการทำ purification เนื่องจากการจับตัวเป็นก้อนและโปรตีนอื่น ๆ จะถูกตัดออกในระหว่างการเตรียมตัวอย่าง
ตาม Heitzer และเพื่อนร่วมงานต่อไปนี้เป็นประเด็นเฉพาะบางอย่างที่ต้องได้รับการแก้ไขเพื่อควบคุมศักยภาพการวินิจฉัยของ ctDNA:
ขั้นตอนก่อนการวิเคราะห์เชิงวิเคราะห์จำเป็นต้องมีมาตรฐาน ... การคัดเลือกวิธีการแยกที่ช่วยให้การสกัดดีเอ็นเอมีคุณภาพสูงเป็นสิ่งสำคัญและได้มีการแสดงให้เห็นว่าปัจจัยทาง preanalytical ของการสุ่มตัวอย่างและการประมวลผลเลือดสามารถส่งผลต่อผลผลิตของดีเอ็นเอได้ดี ... ประการที่สองประเด็นที่สำคัญที่สุดประการหนึ่งคือการขาดการประสานกันของวิธีการหาปริมาณ วิธีการวัดปริมาณที่แตกต่างกัน ... ทำให้เกิดผลลัพธ์ที่แตกต่างกันเนื่องจากการวัดเหล่านี้มุ่งเป้าหมายไปที่ DNA แบบรวมหรือเพียงอย่างเดียว ... ประการที่สามไม่ค่อยมีใครรู้จักเกี่ยวกับต้นกำเนิดและกลไกของการปลดปล่อย ctDNA โดยละเอียดและในการศึกษาส่วนใหญ่จะทำให้เกิดเหตุการณ์สับสนซึ่งอาจมีส่วนช่วยในการปลดปล่อย ctDNA
วิธีการกำหนดเป้าหมายและไม่กำหนดเป้าหมาย
ขณะนี้มีสองวิธีหลักที่ใช้ในการวิเคราะห์พลาสมาเลือด (หรือซีรัม) สำหรับ ctDNA วิธีการแรกมีการกำหนดเป้าหมายและค้นหาการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมเฉพาะที่บ่งบอกถึงเนื้องอก วิธีที่สองไม่มีเป้าหมายและเกี่ยวข้องกับการวิเคราะห์จีโนมทั้งหมดเพื่อหา ctDNA ที่สะท้อนถึงโรคมะเร็ง อีกทางเลือกหนึ่งคือการนำ sequencing มาใช้เป็นแนวทางที่ไม่คำนึงถึงค่าใช้จ่ายที่มีประสิทธิภาพมากขึ้น รายได้เป็นส่วนของดีเอ็นเอที่ถ่ายทอดสัญญาณเพื่อสร้างโปรตีน
ด้วยวิธีการที่กำหนดเป้าหมายซีรั่มจะวิเคราะห์การกลายพันธุ์ทางพันธุกรรมที่รู้จักกันในกลุ่มเล็ก ๆ ที่มีการกลายพันธุ์ของคนขับ
การกลายพันธุ์ของคนขับหมายถึงการกลายพันธุ์ในจีโนมที่ส่งเสริมหรือ "ผลักดัน" การเจริญเติบโตของเซลล์มะเร็ง การกลายพันธุ์เหล่านี้รวมถึง KRAS หรือ EGFR
เนื่องจากความก้าวหน้าทางเทคโนโลยีในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมาวิธีการที่กำหนดเป้าหมายในการวิเคราะห์จีโนมสำหรับ ctDNA จำนวนน้อยได้กลายเป็นไปได้ เทคโนโลยีเหล่านี้ประกอบด้วย ARMS (amplification refractory mutation system); ดิจิตอลพีซีอาร์ (dPCR); ลูกปัด, อิมัลชัน, เครื่องขยายและเครื่องกำเนิดไฟฟ้า (BEAMing); และลำดับขั้นลึก (CAPP-Seq)
แม้ว่าจะมีความก้าวหน้าทางเทคโนโลยีที่ทำให้แนวทางที่กำหนดเป้าหมายเป็นไปได้เป้าหมายที่กำหนดเป้าหมายจะมีเป้าหมายเพียงไม่กี่ตำแหน่งในการกลายพันธุ์ (hotspots) และคิดถึงการกลายพันธุ์ของคนขับจำนวนมากเช่นยีนปราบปรามเนื้องอก
ประโยชน์หลักของวิธีการที่ไม่ตรงเป้าหมายในการตรวจชิ้นเนื้อของเหลวคือพวกเขาสามารถนำมาใช้ในผู้ป่วยทุกรายเนื่องจากข้อเท็จจริงที่ว่าการทดสอบไม่ได้อาศัยการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมที่เกิดขึ้นอีก การเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมซ้ำ ๆ ไม่ครอบคลุมถึงมะเร็งทั้งหมดและไม่ใช่ลายเซ็นมะเร็งที่เฉพาะเจาะจง อย่างไรก็ตามวิธีนี้ขาดความสามารถในการวิเคราะห์และการวิเคราะห์จีโนมของเนื้องอกยังไม่สามารถทำได้
จากโน้ตราคาของลำดับจีโนมทั้งหมดลดลงอย่างมาก ในปี 2549 ราคาของลำดับจีโนมทั้งหมดอยู่ที่ประมาณ 300,000 เหรียญ (USD) โดยปี 2017 ค่าใช้จ่ายลดลงเหลือประมาณ 1,000 เหรียญต่อจีโนมรวมถึงสารทำปฏิกิริยาและค่าตัดจำหน่ายของเครื่องตัดเฉือน
ประโยชน์ทางคลินิกของ Biopsy Liquid
ความพยายามเริ่มต้นในการใช้ ctDNA คือการวินิจฉัยและเปรียบเทียบระดับในผู้ป่วยที่มีสุขภาพดีกับผู้ป่วยมะเร็งหรือผู้ที่เป็นโรคที่ไม่เป็นพิษ ผลของความพยายามเหล่านี้มีความหลากหลายโดยเฉพาะการศึกษาที่แสดงถึงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญซึ่งบ่งชี้ว่าเป็นมะเร็งสถานะปลอดโรคหรือการกำเริบของโรค
เหตุผลที่ ctDNA สามารถใช้เพียงบางช่วงเวลาในการวินิจฉัยโรคมะเร็งได้เนื่องจากจำนวนตัวแปรของ ctDNA จะมาจากเนื้องอก ไม่เนื้องอกทั้งหมด "หลั่ง" ดีเอ็นเอในปริมาณเดียวกัน โดยทั่วไปแล้วเนื้องอกที่แพร่หลายมากขึ้นจะแพร่กระจายดีเอ็นเอไปสู่การไหลเวียนมากกว่าเนื้องอกที่มีการแปลเป็นภาษาท้องถิ่น นอกจากนี้ชนิดเนื้องอกที่แตกต่างกันหลั่งจำนวน DNA ที่แตกต่างกันเข้าสู่การไหลเวียน เศษของการไหลเวียนดีเอ็นเอที่ได้จากเนื้องอกเป็นตัวแปรในการศึกษาและโรคมะเร็งประเภทตั้งแต่ 0.01% ถึง 93% เป็นสิ่งสำคัญที่จะต้องทราบว่าโดยทั่วไปเพียงส่วนน้อยของ ctDNA มาจากเนื้องอกส่วนที่เหลือของมันมาจากเนื้อเยื่อปกติ
การหมุนเวียนดีเอ็นเอสามารถใช้เป็นเครื่องหมายพยากรณ์โรคได้ การหมุนเวียนดีเอ็นเอสามารถนำมาใช้เพื่อติดตามการเปลี่ยนแปลงของโรคมะเร็งในช่วงเวลา ตัวอย่างเช่นหนึ่งการศึกษาพบว่าอัตราการรอดตายสองปีในผู้ป่วยมะเร็งลำไส้ใหญ่และทวารหนัก (เช่นจำนวนผู้ป่วยยังคงมีชีวิตอยู่อย่างน้อยสองปีหลังจากได้รับการวินิจฉัยว่าเป็นมะเร็งลำไส้ใหญ่) และการกลายพันธุ์ของ KRAS hotspot เป็นร้อยละ 100 ในผู้ที่ไม่มีหลักฐาน ดีเอ็นเอหมุนเวียนที่เกี่ยวข้อง นอกจากนี้ยังเป็นไปได้ว่าในอนาคตอันใกล้การแพร่กระจายดีเอ็นเอสามารถนำมาใช้เพื่อตรวจหารอยโรคมะเร็งได้
นอกจากนี้ยังสามารถใช้ดีเอ็นเอในการไหลเวียนเพื่อติดตามการตอบสนองต่อการรักษาด้วย เนื่องจากดีเอ็นเอหมุนเวียนมีภาพลักษณ์ที่ดีขึ้นของการสร้างพันธุกรรมของเนื้องอก DNA นี้น่าจะมีดีเอ็นเอในการวินิจฉัยซึ่งสามารถใช้แทนดีเอ็นเอในการวินิจฉัยที่ได้จากเนื้องอกด้วยตัวเอง
ตอนนี้ลองมาดูตัวอย่างบางส่วนของ biopsy ของเหลว
Guardant360
Guardant Health ได้พัฒนาแบบทดสอบที่ใช้การจัดเรียงลำดับถัดไปไปยังข้อมูลดีเอ็นเอที่หมุนเวียนข้อมูลสำหรับการกลายพันธุ์และการ rearrangements โครโมโซมสำหรับยีนที่เกี่ยวกับมะเร็ง 73 ตัว Guardant Health เผยแพร่ผลการศึกษาที่รายงานถึงประโยชน์ของ biopsy ของเหลวในด้านเนื้องอกวิทยา การศึกษาได้ใช้ตัวอย่างเลือดจากผู้ป่วย 15,000 รายที่มีเนื้องอกร่วมกัน 50 ชนิด
ส่วนใหญ่ผลจากการทดสอบ biopsy ของเหลวสอดคล้องกับการเปลี่ยนแปลงของยีนที่สังเกตได้ในเนื้อเยื่อเนื้องอก
อ้างอิงจาก NIH:
Guardant360 ระบุการกลายพันธุ์ที่สำคัญเช่นเดียวกับยีนที่เกี่ยวข้องกับโรคมะเร็งอย่าง EGFR, BRAF, KRAS และ PIK3CA ที่ความถี่ใกล้เคียงกับสิ่งที่เคยได้รับการระบุไว้ในตัวอย่างเนื้อเยื่อเนื้องอกที่มีความสัมพันธ์ทางสถิติกับ 94% ถึง 99%
นอกจากนี้ตาม NIH นักวิจัยรายงานต่อไปนี้:
ในส่วนที่สองของการศึกษานักวิจัยได้ประเมินผู้ป่วยเกือบ 400 รายซึ่งส่วนใหญ่เป็นมะเร็งปอดหรือมะเร็งลำไส้ใหญ่ซึ่งมีทั้งผลการตรวจดีเอ็นเอของ ctDNA ในเลือดและเนื้อเยื่อเนื้องอกและเปรียบเทียบรูปแบบของการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรม ความถูกต้องโดยรวมของการตรวจชิ้นเนื้อของเหลวเมื่อเทียบกับผลการวิเคราะห์ biopsy เนื้อเยื่อมะเร็งคือ 87% ความแม่นยำเพิ่มขึ้นเป็น 98% เมื่อเก็บตัวอย่างเลือดและเนื้องอกภายใน 6 เดือน
Guardant360 ถูกต้องแม้ว่าระดับดีเอ็นเอในเลือดจะอยู่ในระดับต่ำ บ่อยครั้งการแพร่กระจายดีเอ็นเอของเนื้องอกเพียงร้อยละ 0.4 ของดีเอ็นเอในเลือด
โดยรวมแล้วการใช้ biopsy ของเหลวนักวิจัยของ Guardant สามารถระบุตัวบ่งชี้เนื้องอกที่สามารถนำการรักษาไปใช้โดยแพทย์ในผู้ป่วยได้ 67 เปอร์เซ็นต์ ผู้ป่วยเหล่านี้มีสิทธิ์ได้รับการรักษาโดย FDA และวิธีการรักษา
ctDNA และมะเร็งปอด
ในปี 2016 FDA ได้อนุมัติการทดสอบการกลายพันธุ์ cobas EGFR Mutation เพื่อใช้ในการตรวจหาการกลายพันธุ์ของ EGFR ในดีเอ็นเอที่กำลังหมุนเวียนของผู้ป่วยมะเร็งปอด การตรวจครั้งนี้เป็นครั้งแรกที่ได้รับการรับรองจากองค์การอาหารและยา (FDA) และระบุผู้ป่วยที่อาจเป็นผู้สมัครรับการรักษาโดยใช้ยา erlotinib (Tarceva), afatinib (Gilotrif) และ gefitinib (Iressa) เป็นยาอันดับแรกและยา osimeritinib (Tagrisso) การรักษาที่สอง การรักษาเป้าหมายเหล่านี้โจมตีเซลล์มะเร็งที่มีการกลายพันธุ์โดยเฉพาะของ EGFR
สิ่งสำคัญเนื่องจากผลการตรวจ FDA เป็นจำนวนมาก FDA แนะนำให้ทำตัวอย่างเนื้อเยื่อเนื้อเยื่อจากผู้ป่วยที่มี biopsy เหลวเป็นลบ
ctDNA และมะเร็งตับ
จำนวนผู้ที่เสียชีวิตจากโรคมะเร็งตับเพิ่มขึ้นในช่วง 20 ปีที่ผ่านมา ปัจจุบันโรคมะเร็งตับเป็นสาเหตุอันดับที่สองของการเสียชีวิตด้วยโรคมะเร็งในโลก ไม่มี biomarkers ที่สามารถตรวจจับและวิเคราะห์ตับหรือมะเร็งตับ (HCC) มะเร็งได้ การหมุนเวียนดีเอ็นเออาจเป็น biomarker ที่ดีสำหรับมะเร็งตับ
พิจารณาใบเสนอราคาต่อไปนี้จาก Lagbaa และผู้ร่วมเขียนเกี่ยวกับศักยภาพของการใช้ดีเอ็นเอหมุนเวียนในการวินิจฉัยมะเร็งตับ:
hypermethylation ของ RASSF1A, p15 และ p16 ได้รับการแนะนำเป็นเครื่องมือในการวินิจฉัยต้นในการศึกษาย้อนหลังรวมทั้งผู้ป่วย HCC 50 มีการตรวจสอบลายเซ็นของยีน methylated aberrantly methylated 4 ยีน (APC, GSTP1, RASSF1A และ SFRP1) เพื่อตรวจสอบความแม่นยำในการวินิจฉัยขณะที่ methylation ของ RASSF1A ถูกรายงานว่าเป็น prognostic biomarker การศึกษาในภายหลังได้วิเคราะห์ ctDNA ในผู้ป่วยโรคมะเร็งปัสสาวะ (HCC) โดยใช้เทคโนโลยีการจัดลำดับขั้นลึก (Deep sequencing technologies) พบว่ามีการตรวจพบสำเนาดีเอ็นเอของไวรัสในผู้ป่วย HBV สองรายที่ไม่เคยมีประวัติของ HCC ในขณะที่ได้รับการตรวจเลือด แต่ผู้ที่พัฒนา HCC ในระหว่างการติดตามผล การค้นพบนี้เปิดประตูเพื่อประเมินรูปแบบจำนวนสำเนาใน ctDNA เป็นเครื่องมือคัดกรองสำหรับการตรวจหา HCC ในช่วงต้น
คำจาก
การตรวจชิ้นเนื้อของเหลวเป็นวิธีการใหม่ที่น่าตื่นเต้นในการวินิจฉัยเกี่ยวกับจีโนม ปัจจุบันมีการตรวจชิ้นเนื้อที่เป็นของเหลวซึ่งมีข้อมูลเกี่ยวกับระดับโมเลกุลที่ครอบคลุมเพื่อให้แพทย์สามารถเติมเต็มข้อมูลทางพันธุกรรมที่ได้จากการตรวจชิ้นเนื้อเนื้อเยื่อ นอกจากนี้ยังมี biopsies ของเหลวบางชนิดที่สามารถนำมาใช้แทนการ biopsy เนื้อเยื่อ - เมื่อเนื้อเยื่อ biopsies ไม่พร้อมใช้งาน
เป็นสิ่งสำคัญที่ต้องจำไว้ว่าการทดลอง biopsy ของเหลวหลายอย่างกำลังดำเนินอยู่อย่างต่อเนื่องและจำเป็นต้องมีการวิจัยเพิ่มเติมเพื่อทำให้เกิดประโยชน์ในการรักษาโรคของการแทรกแซงนี้
> แหล่งที่มา:
การทดสอบเลือดเพื่อการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมในเนื้องอกแสดงให้เห็นว่าสัญญาเป็นทางเลือกในการทำ Biopsy เนื้องอก NIH
> Heitzer E, Ulz P, Geigl JB การถ่ายโอนดีเอ็นเอของเนื้องอกเป็น Biopsy Liquid สำหรับมะเร็ง เคมีทางคลินิก 2015; 61: 112-123 doi: 10.1373 / clinchem.2014.222679
Lagbaa J, Villanueva A. การตรวจชิ้นเนื้อในมะเร็งตับ เวชศาสตร์การค้นพบ 2015; 19 (105): 263-73
Biopsy Liquid: การใช้ดีเอ็นเอในเลือดเพื่อตรวจหาติดตามและรักษามะเร็ง NIH
> Umetani N, et al. ปริมาณดีเอ็นเอที่หมุนเวียนในซีรัมในพลาสมาไม่ได้เกิดจากเชื้อ DNA ที่ปนเปื้อนในระหว่างการแยก แอนนิวยอร์ก Acad Sci 2006; 1075: 299-307
> Wellstein A. หลักการทั่วไปในการบำบัดด้วยยาของโรคมะเร็ง ใน: Brunton LL, Hilal-Dandan R, Knollmann BC สหพันธ์ Goodman & Gilman's: พื้นฐานทางเภสัชวิทยาในการบำบัด, นิวยอร์ก, นิวยอร์ก 13: McGraw-Hill